题目 在以治愈为导向的临床试验中测量 HIV 病毒库大小的建议 抗逆转录病毒疗法(ART)通过有效地将病毒复制抑制到血浆中检测不到的水平，显着降低了 HIV 感染者(PWH)的发病率和死亡率。然而，ART需要终生给药并且不能根除 HIV，它会继续导致免疫激活、慢性炎症和对多个器官系统的持续损害。因此，需要有效的治疗策略来治愈HIV感染。 治愈 HIV 的主要障碍是病毒在血液中和不同解剖部位建立了持续感染细胞的稳定储存库。尽管长期抗逆转录病毒疗法，这些病毒库仍然存在，并且可以大致分为两组。在“潜在病毒库”中，细胞携带不表达病毒转录本或蛋白质的病毒基因组的整合副本。这些潜伏的前病毒不受 ART 影响或被免疫系统清除；然而，它们可以在刺激后恢复到病毒生产状态。除了潜在的病毒库，活跃的病毒库是一小群转录活性细胞，产生 HIV RNA、蛋白质和可能的病毒粒子，尽管长期 ART，但仍可在HIV感染者( PWH)中检测到。针对并消除这两种类型的宿主是寻求 HIV 治愈的重点。 目前，一些临床试验正在进行中，以评估治疗艾滋病毒的潜在治疗策略的效果。这些试验的成功取决于在干预前后测量艾滋病毒库大小的能力，并利用这一信息指导抗逆转录病毒治疗的中断。然而，对于如何使用目前可用的各种测定方法来评估在没有抗逆转录病毒疗法的情况下可能引起病毒反弹的艾滋病毒宿主的大小，目前尚无共识。从这个角度来看BEAT-HIV Martin Delaney合作实验室提供了我们关于在HIV治疗导向的临床试验中哪些病毒测量应该优先考虑的共同观点。 ∨ 测量HIV宿主的挑战 在目前针对 ART 抑制的 PWH 的 HIV 治愈导向研究中，测量了总前病毒 DNA、完整前病毒、转录活性前病毒（病毒 RNA）、翻译活性前病毒（蛋白质）和复制活性病毒的水平。这些临床研究主要通过使用四种样本类型来测量这些病毒成分：外周血单核细胞 (PBMC)，通过采血或白细胞分离术获得，以及来自肠道相关淋巴组织 (GALT) 或淋巴结 (LN) 的活检。单个隔间的测量不可能提供 ART下储层动态的全貌。大多数临床试验设计主要收集外周血，因为纵向取样很容易；参与者献血的意愿；低成本、高通量和易于在全球临床站点收集。如前所述，在一些临床试验中也收集了 GALT 和 LN 活检。尽管 HIV 可能会在其他组织中持续存在，但收集这些其他组织具有挑战性。 用于在 HIV 治愈导向的临床试验设计中优先考虑当前可用的措施，如下所示（图 1）。 图1 当前用于病毒检测和评估 HIV 病毒库大小的策略的对比如下: 当前的病毒检测和评估 HIV 病毒库大小的策略 方法 检测内容 优点 缺点 刺激和/或扩张 测量可复制病毒或完整 HIV 基因组水平的方法 QVOA 具有复制能力的 HIV 细胞的频率，可以在体外被诱导产生传染性病毒 确定可复制 HIV 病毒库大小的测定；进化枝独立 低估了具有复制能力的 HIV 储存库的大小；对许多细胞的要求；时间、劳动力和成本密集型 离体刺激后扩增 使用支持 HIV 复制的细胞系改良 QVOA 具有复制能力的 HIV 细胞的频率，可以在体外被诱导产生传染性病毒 与传统 QVOA 相比，劳动强度更低，一致性更高；进化枝独立 低估了具有复制能力的 HIV 储存库的大小；对许多细胞的要求；成本密集 离体刺激后扩增 Q2VOA 可以离体诱导的编码 HIV 前病毒 DNA 的细胞的频率，以及潜伏病毒的遗传和潜在表型特征 为 HIV 前病毒 DNA 的定性提供更多见解 低估了具有复制能力的病毒的大小，因为它错过了具有复制能力的非诱导前病毒，类似于传统的 QVOA；劳动力、时间和成本密集；分析测序部分的潜在进化枝依赖性 离体刺激后扩增 IPDA：通过针对前病毒 DNA 多个区域的数字液滴 PCR 的 HIV DNA，以排除删除和超突变的前病毒 编码完整和有缺陷的前病毒 HIV DNA 的细胞频率 消除 97% 的有缺陷的原病毒；预测潜在储层的大小仅高估了约 1.5 倍；比传统 QVOA 更简单、成本更低、速度更快 某些患者的序列多态性可能会阻止扩增；对替代引物或探针的要求；进化枝依赖； 无法测量前病毒诱导性 无需刺激或扩增 通过限制稀释四探针 qPCR 对 HIV DNA 进行序列验证，然后对两个或多个探针呈阳性的反应进行序列验证 (Q4PCR) 通过测序确认编码完整和有缺陷的前病毒 HIV DNA 的细胞频率 可复制病毒水平的估计； 测序验证的结果； 灵敏度 与 IPDA 相比，吞吐量更低，时间和劳动强度更高；成本密集；进化枝依赖；缺乏对原病毒诱导性的测量；缺乏绝对 量化 无需刺激或扩增 近全长个体前病毒测序（FLIP-seq） 基因完整的原病毒的水平和遗传特征 明确测量基因完整的原病毒水平 时间、劳动力和成本密集型； 定制引物设计的要求 无需刺激或扩增 前病毒超深度测序 基因完整的原病毒水平 比单基因组测序更具成本效益和简单性 潜在的模板重采样和 PCR 错误或偏差；成本密集；进化枝依赖 无需刺激或扩增 高通量整合位点序列分析 HIV前病毒整合的分布，与克隆丰度相关的信息 有效报告整合位点的位置以及插入诱变和克隆扩增之间的关联 需要专业知识； 成本密集； 样品分析所需的前病毒的可行数量要求 无需刺激或扩增 MIP–seq 单个前病毒序列和相应的染色体整合位点 研究完整 HIV-1 前病毒的染色体定位和整合位点特征 技术复杂性； 成本密集 无需刺激或扩增 mVOA 测试的细胞或组织中是否存在具有复制能力的病毒 检测低水平的潜伏感染； 进化枝独立 如果需要定量值，则要求每个样本有多个动物； 对许多细胞的要求； 成本密集 体内扩增 测定可诱导的翻译或转录能力病毒的方法 改进的QVOA使用超灵敏读数(包括QVOA p24 SIMOA和QVOA cfRNA) 可以离体诱导的具有转录和翻译能力的 HIV 细胞的频率 简单快速； 比 QVOA 需要更少的单元；检测具有转录和翻译能力的病毒 检测感染了能够产生病毒 RNA 或蛋白质的无法复制的病毒的细胞；中等劳动强度，除非自动化；成本密集 离体刺激后扩增（除非在存在 ART 的情况下进行） 细胞相关 p24 蛋白定量 在存在或不存在离体刺激的情况下生产性 HIV p24 表达 灵敏度、简单性、快速性和相对成本效益； 要求相对较少的细胞； 跨样本类型的适用性； 测量有效表达“活跃”和“诱导”储层；比测量 HIV 转录本更接近复制能力；免疫反应的生物学相关靶点和基于免疫的介入方法 由于检测到具有翻译能力的前病毒而不是具有复制能力的病毒，可能会高估水库的大小 不需要刺激；通常在短暂的离体刺激下进行，但无需扩增 基于诱导的病毒 RNA 再激活试验（包括 TILDA） 含有可转录重新激活的 HIV Tat/Rev 多重拼接 RNA 的细胞数量 比 QVOA 更简单、更快速；比 QVOA 需要更少的单元；可用于测量体外潜伏期逆转剂的反应 测量 HIV 转录物的诱导水平（转录能力），不区分缺陷和复制能力；成本密集；中等劳动强度，除非自动化 短暂的离体刺激但无需扩增 诱导型病毒的单细胞分析（包括 FISH-flow） 在单细胞水平刺激后经历 HIV 转录和/或翻译的细胞频率 对 HIV 转录和/或翻译的单细胞洞察；单个细胞的表型表征；进化枝独立性；相对成本效益 缺乏对复制能力的衡量 不需要刺激；通常在短暂的离体刺激下进行，但无需扩增 测定 HIV DNA和细胞相关 HIV RNA 的组成水平的方法 通过 qPCR 或液滴数字 PCR 检测细胞相关 HIV RNA HIV 转录物水平（转录能力细胞HIV的替代物），不区分有缺陷的、翻译能力强的或复制能力强的 快速、相对成本效益和敏感性； 细胞保留； 跨样本类型的适用性；测量不同 HIV 转录物以确定HIV转录活性程度的能力；储库大小的潜在替代测量，因为ART期间的HIV RNA水平可预测治疗停止后病毒反弹的时间 高估了潜在的 HIV 病毒库的大小；缺乏对翻译能力或复制能力的衡量；进化枝依赖 无需刺激或扩增 通过qPCR 或微滴数字PCR 检测HIV DNA 艾滋病毒DNA的总、完整或环状选定区域的水平，不区分缺陷原病毒和复制能力原病毒 快速、成本效益、敏感性；细胞保留；跨样本类型的适用性； 跨越不同进化枝的能力（在大多数可用的测定中） 大大高估了 HIV 病毒库的大小，因为只有一小部分 HIV 基因组可以在离体刺激后重新激活以产生具有复制能力的病毒 无需刺激或扩增 基于原位杂交的分析，例如 DNAscope和RNAscope 与整合(DNA)或转录(RNA)相关的 HIV 序列的细胞定位和水平，不区分缺陷型和复制型 组织中感染细胞的可视化和表型表征；提高对体内感染细胞解剖分布的理解；成本效益; 灵敏度接近定量实时PCR的灵敏度 缺乏对复制能力的衡量；进化枝依赖 无需刺激或扩增 测量 HIV 宿主体内负担的方法 超敏感残留病毒血症 ART期间体内释放的HIV颗粒，不区分组织来源 从稳定的储存库中读取病毒释放，包括组织中的病毒释放； 相对成本效益 需要大量血浆或体液； 有限的动态范围；ART 期间HIV宿主与低水平病毒血症之间的关系不明确；进化枝依赖 无需刺激或扩增 ATI（测试 ART 病毒负担的常用策略，但不是“分析”；仅用于比较） ART停止后体内系统性病毒复制，不区分组织来源 确定 ART 停止后 HIV 缓解的持续时间；干预措施对 HIV 感染的全身负担影响的最具临床相关性的测量 停止治疗的个人及其伴侣的潜在临床风险；临床要求高； 需要大量减少病毒库以显着延迟病毒反弹，从而使当前的任何干预措施都不太可能显着延迟病毒反弹； 工作量和监控成本密集度 体内扩增 —— 上下滑动查看完整表格 ——
要注意的是，一种方法不能适用于所有情况，需要结合ART的病毒测量方法的检测内容，以及在与HIV治疗相关的临床试验中应该如何优先考虑和分析它们，可能会因预期的病毒清除机制而不同;通过单细胞技术对艾滋病毒宿主进行额外测量的新方法;以及资源和样本的可用性。总而言之，研究计划必须仔细权衡形成选定实验的最终机制，并将其与用于未来检验的样本库的价值相比较。
内容来源于：Quanterix生物技术
