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目前，尽管抗逆转录病毒抑制治疗(ART)仍能长期维持病毒学抑制，但HIV-1感染的治愈仍难以实现，由于受感染的细胞含有完整基因组、染色体整合的病毒DNA。在开始抗逆转录病毒治疗后，这些细胞（这里称为HIV-1储存库细胞）的频率会随着时间的推移而减少，然而，这个过程是缓慢的，并且对其下降机制尚不十分了解。抗逆转录病毒疗法本身不太可能直接导致病毒库细胞的纵向减少，因为抗病毒药物对病毒感染的细胞没有细胞毒性活性；它们仅仅是保护未感染HIV的细胞免受病毒感染，并阻止新的病毒储存库细胞的形成。

相反，免疫机制在抗逆转录病毒治疗期间可能在HIV-1储存库细胞的纵向减少中发挥重要作用。因此，作者开展了这项研究，旨在探讨不同的免疫学特征使HIV-1感染的细胞能够抵抗宿主免疫效应并终身存活的机制。

为了了解HIV-1储存细胞对宿主免疫反应的敏感性或抵抗力，研究其表面表型是非常重要的。作者开发了一种名为“单细胞转录组+表面蛋白测序技术”(CITE-seq)的实验策略，可以对HIV-1感染的细胞进行全面评估。该方法联合分析单细胞的表型标记和染色体DNA。我们在研究中选择了作为HIV-1的储存库CD4⁺T细胞（n=5）作为样本，测定了53个T细胞表面的蛋白。通过PCR测定每个感染细胞中的前病毒序列。

在对来自PB的HIV-1感染细胞进行表型的初步分析时，我们使用UMAP图对不同类别的mCD4⁺T细胞进行了可视化。2类和3类细胞的表型特征则明显偏离0、1和4类细胞，并在簇内显示出更成熟的效应记忆的特征，表现为高水平的CD45RO表达和低水平的CCR7和CD62L表达。这些结果表明，细胞编码完整的原病毒和/或作为大型原病毒克隆的一部分表现出独特的表型特征，而第1类和第4类中的病毒感染细胞主要由含有缺陷的淋巴细胞组成，在表型上与未感染的细胞基本上没有区别。

我们发现许多表面标记在1类HIV-1感染细胞中相对于未感染HIV的细胞显着富集。然而，由于1类细胞的数量相对较高，某些标记的生物学意义值得怀疑，因为只有很少比例的1类细胞被这些标记呈阳性，或者富集倍数相当有限。对于其他表面标记，如CD276、GITR、CD57、白细胞介素10受体（IL-10R）、HLA-DR、CD38和OX40，它们在1类细胞中的表达差异相对较小。与此相反，对于4类细胞，相对于未感染HIV的细胞，我们也观察到一些表型差异。

对于2类细胞，作者注意到与T细胞功能抑制相关的一系列标记在这些细胞中具有更明显的统计富集。这些标记物包括免疫检查点受体PD1、TIGIT、BTLA、2B4和KLRG1；而CTLA4、TIM3和LAG3的表达变化则非常微小且不显著。这些标记物可能通过提高细胞激活的阈值来限制前病毒基因的表达，并降低病毒储存库细胞对宿主免疫识别机制的可见性和脆弱性。

尤其值得注意的是，2类细胞表现出多种标记物的表达升高，这些标记物作为免疫抑制性受体的配体，可以增加效应细胞（如CD8⁺T细胞或自然杀伤细胞）对它们的抵抗力，从而通过负调节免疫活性来抑制免疫调节脉冲。过度表达这些标记物可能会保护HIV-1感染细胞免受细胞免疫反应的影响，并可能使它们在演化中获得纵向选择优势。具体而言，我们观察到疱疹病毒进入介质（HVEM）的上调，通过结合对T细胞和NK细胞进行负调节的BLAT29和CD160，这些有已知的病毒保护作用，可以使受感染细胞抵抗宿主免疫效应，得到了人类CMV编码的HVEM旁系同源物UL144的支持。

此外，我们还注意到脊髓灰质炎病毒受体（PVR）的上调，它通过与高亲和力配体TIGIT33和KIR2DL5相互作用，可以抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性作用。还观察到2类细胞中PDL1的富集，它是PD1和HLA-E（非经典MHC类别）的生理配体分子，是NK和T细胞上表达的抑制性受体NKG2A的高亲和力配体。然而，这些标记物在数量更有限的细胞上表达，并且统计分数较弱（经过FDR调整后的P值分别为0.02和0.04，对于HLA-E和PDL1）。含有完整HIV-1 DNA的2类细胞进一步富集CD49d的更高水平表面表达，以及CD45RO和CD95，所有这些都与T细胞激活和针对效应器记忆的分化有关。此外，它们还表现出转化生长因子β（TGFβ）的上调，这可以促进原病毒潜伏期的细胞受体，并且还显示出IL-21和CD127（稳态细胞因子IL-7的受体）的增加表达。

对于含有克隆扩增原病毒的细胞（类别3），我们特别分析了它们的表型。我们注意到KLRG1表达在这些细胞中有明显的富集，除了作为与E-cadherin结合的抑制性检查点标记物的作用外，它还与细胞终末分化和衰老有关。这表明KLRG1在类别3细胞中的富集可能反映了这些特定细胞群强大的克隆增殖历史。类别3细胞中的PDL1表达表明该标记物对保护HIV-1感染的克隆细胞抵抗T细胞免疫攻击起到了作用。

在与T细胞功能抑制相关的标记物中，TIGIT在类别3细胞中表现出最显著的上调；PD1的表达在类别3细胞的BTLA中也有所增加。通过分析HIV-1储存细胞的单个克隆，我们进一步研究了共享相同染色体整合位点的克隆性HIV-1感染细胞的表型。在全局分析中，属于相同细胞克隆的细胞倾向于彼此靠近聚集，这表明HIV-1感染细胞的表型行为相当同质，源自同一克隆；然而，一些克隆显示出更高水平的表型变异。此外，我们还注意到类别3特异性免疫调节标志物的上调在细胞克隆之间不是特定的，而是在大多数细胞中都出现相对一致的表现；尽管如此，一些克隆之间的表型多样性仍值得在未来的研究中进一步探究。

随后，我们对可能在HIV-1感染细胞上联合上调的表面标记进行了组合分析，使用了先前开发的用于多元流式细胞术数据集的算法。额外的研究表明，经过长时间的病毒抑制后，不表达与保护相关的标记物的细胞在0类和1类细胞中被T或NK细胞杀死的比例显著较高，而同时表达两种或多种这些标记物的细胞在2类和3类细胞中显著增加。

类似的观察也应用于免疫检查点分子（PD1、KLRG1、BTLA和TIGIT）。然而，组合分析未能证明类别2和类别3细胞中明显丰富或与免疫激活相关的标记组合（如CD38、CD49d、CD95、CD69和HLA-DR）。这些评估频率的实验证实了在mCD4⁺细胞中，表达完整原病毒的T细胞所描述的标记组合，尽管不同研究参与者之间的表型模式存在一些差异。

综上所述，我们的结果表明类别2和类别3储存细胞具有整体表型特征，可能降低细胞重新激活原病毒基因转录倾向的免疫检查点分子，并具备能够保护受感染靶细胞免遭T和NK杀伤的标记组合。这样的表型特征似乎在进化上是有利的，通过最大限度地减少宿主免疫效应细胞的暴露和杀伤，与功能研究一致，表明HIV-1储存细胞对T细胞介导的杀伤的抵抗力增强。功能实验也使用我们研究参与者的细胞，表明编码完整的储存细胞具有增强HIV-1 DNA对HIV-1特异性CD8⁺T细胞介导的杀伤抵抗力。

我们对HIV-1储存细胞的表型概况进行了纵向评估，对参与者1和2在ART开始后早期（1-2年）收集的PB样本进行了PheP-seq测定。共分析了257,574个mCD4⁺T细胞从这些早期时间点开始，其中分别有4,156个和44个被分类为1类和2类细胞。值得注意的是，2类储存细胞已经表现出在ART开始后早期时间点的T或T细胞抑制性受体的免疫检查点标记和配体表达水平增加，尽管这种变化相对于ART较晚时间点而言不太明显，如PVR和HVEM。此外，延长ART持续时间后，还存在IL-21和TGFβ受体表达升高的趋势。总的来说，这些观察结果表明，储存细胞的选择在ART开始后早期就已经开始，可能意味着只有一小部分具有特定表型特性的2类细胞子集注定会进入持久的储存细胞池。而在更长时间的ART治疗后，1类储存细胞从早期时间点开始表现出的表型变异相对于未感染者相比较小，来自同一时间点的细胞表现出的差异也很小。然而，由于分析的细胞数量较少，难以对早期和晚期ART之间的类别3细胞进行比较。

由于大多数HIV-1储存细胞位于淋巴组织中，我们随后对病毒感染细胞进行了表型分析，这些细胞来自通过手术切除收集的腹股沟淋巴结（LN），来自三名已持续接受抑制性ART治疗约10-15年的HIV-1感染者。全球表型分析LN中的HIV-1储存细胞景观表明，病毒储存细胞在两种不同的细胞中表现出局灶性富集簇，其特征是CXCR5的高水平表面表达，表明滤泡辅助T细胞（TFH）极化，以及第二个簇以CD127和CD69表达升高为特征，提示LNs中的CD4⁺T组织驻留记忆T细胞（TRM）概况。然而，TFH细胞占第1类细胞的大部分，与之前的结果一致，2类细胞在TFH细胞和TRM细胞之间存在。

在LN中，2类细胞上调了一些免疫检查点标记；然而，与PB中的2类储存细胞相比，统计分数和丰富率相对较弱。同样，赋予抵抗性的标记在LN中2类细胞的T或NK细胞杀伤作用上调相对于PB中的2类细胞更少，尽管PVR和HLA-E在LN中的2类细胞上调满足统计标准。这些LN中2类细胞之间的差异表型特征相对于血液相比可能与主要存在的非溶细胞性CD8⁺T细胞有关，这可能导致更多具有表型的病毒库细胞的选择优势，从而在该组织隔室中增强对免疫介导杀伤的抵抗力的迹象。

强烈区分类别2的标记在LN中未感染细胞的储存细胞包括CD44、IL-21受体（CD360）、IL-7受体（CD127）以及较小程度的CD28；这些标记在LN中的2类储存细胞相对于含有缺陷原病毒的LN细胞以及来自PB的1类和2类储存细胞都上调。所有这些标记物在功能上都参与介导细胞生存信号；特别是，CD44可以通过参与磷酸肌醇3-激酶-AKT信号通路提高CD4⁺T细胞的存活率和细胞凋亡抗性。此外，T细胞存活信号与AKT信号通路的激活相关，也发生在IL-21受体的下游。同样，CD28在CD4⁺T细胞的存活中起着突出作用；这可能与CD28介导的细胞内在抗凋亡和上调BCL-2家族的标记有关。当应用组合分析时，还检测到LN中2类细胞的细胞存活率。值得注意的是，我们还观察到LN中2类细胞上TNF受体超家族的几个成员的表达升高的趋势，特别是CD30、GITR和OX40，也与介导细胞存活的信号有关。2类和1类或4类储存细胞在LN中之间的表型差异与PB细胞相比并不明确，这一发现需要在未来进行更多的研究。

我们的数据表明LN中的2类储存细胞主要表现出与细胞凋亡抵抗和存活相关的表型特征；这些标记的上调在LN中的2类细胞可能会促进其长期持续存在，可以被视为储存细胞对病毒的免疫适应的标志。

总体来说，这些结果表明，只有一小部分受感染的病毒库细胞能以最佳方式躲避免疫系统，并在长期ART治疗中存活下来。此外，这些数据表明，人类免疫系统能够对大多数HIV病毒库细胞施加有效的免疫选择压力。

但是作者指出，这些生物标志物不太可能在所有接受ART治疗的HIV感染者中普遍存在，因为免疫选择压力可能因个体免疫反应的差异而不同。尽管如此，识别区分HIV病毒库细胞的表型生物标志物可能为未来的HIV-1治愈研究提供信息。